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一、試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性 本試劑盒在室溫儲存 18 個月不影響使用效果。 注意事項 1． 環(huán)境溫度低時細胞核裂解液中某些去污劑成份會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在 37℃ 水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。 2． 蛋白沉淀液可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在 37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，如果不能 完全溶解，也不影響使用效果，直接取用上層溶液即可。 3． 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、PH 值變化，各溶液使用后應及時蓋 緊蓋子。 4. 蛋白酶 K 使用前加水溶解，分裝小份-20℃保存。 二、原理簡介 本試劑盒根據全血特點采用幾個快速步驟提取基因組 DNA。首先紅細胞 裂解液裂解去除不含 DNA 的紅細胞，細胞核裂解液裂解白細胞釋放出基因 組 DNA, 然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組 DNA 通 過異丙醇沉淀并重溶解于 DNA 溶解液。 三、試劑盒特點 1． 從十幾個配方中優(yōu)選出的紅細胞裂解液配方，裂解快速完全。 2． 不需要使用有毒的苯酚等試劑。 3． 快速，簡捷，適合同時提取多個樣品。 4． 結果穩(wěn)定，產量高（典型的產量 5ml 全血可提取出 75-250μg）， OD260/OD280 典型的比值達 1.7～1.9，長度可高達 50Kb-150kb，可 直接用于構建文庫，PCR，Southern-blot 和各種酶切反應。 四、注意事項（實驗前必須首先閱讀這部分！） 1． 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到10,000rpm，并配 備容納50ml離心管轉頭的傳統(tǒng)臺式離心機。 2． 為便于運輸。紅細胞裂解液為 10×，使用時請稀釋成 1×。用戶需 自備異丙醇和 70％乙醇。 3． 典型的產量 5ml 全血可提取出 75-250μg 基因組 DNA（不同樣品尤 其疾病樣品中中白細胞數量差異可能非常大，因此產量的個體差異 也可能非常大）。 4． 本試劑盒為溶液型，可以很容易的按照比例擴大或者縮小每次處理 的全血量（20μl-10ml），請聯(lián)系我們索取其它處理量的操作手冊。 5． 本試劑盒可運用于各種非抗凝劑的全血。 6． 為了最佳效果，最好使用 4℃存放小于 3 天的標本，反復凍融超過 3 次的標本，會嚴重降低產量。 7． 對于每個樣品提取血量大的客戶或者用量大的客戶，可以和我們聯(lián) 試劑盒組成 保存 50 次 (DP6111) 紅細胞裂解液 室溫 150ml 細胞核裂解液 室溫 500ml 蛋白沉淀液 室溫 170ml DNA 溶解液 室溫 30ml 蛋白酶 K（20mg/ml） -20℃ 50mg 離心柱 室溫 50 套 系，我們另有專門準備有優(yōu)惠的大包裝試劑。 五、操作步驟 1．取解凍后含血凝塊的全血 5ml（或 5g）至離心柱中，5,000rpm 離心 10 分鐘，收集下液。 2． 吸取 30ml 紅細胞裂解液到步驟 1 所得的下液中，蓋緊管蓋，Vortex 2-3 分鐘， 3．室溫放置 10 分鐘（期間應該顛倒輕彈混勻數次或者搖床上面輕搖幫 助裂解紅細胞），血塊完全溶解，溶液變澄清。 4．4,000rpm 離心 10 分鐘，棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清 （注意不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團和大約 100μl 的殘留上清。 離心后在管底應該見到白色的白細胞團，也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團 在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細胞團，說明紅細胞裂解很不充分， 應該再加入適量紅細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟 3，4。 5. 渦旋振蕩 15 秒重懸白細胞團，充分分散白細胞團。 白細胞的重懸分散對下一步裂解非常重要，白細胞未打散就加入裂解液，會導 致白細胞不能充分裂解，形成肉眼可見團塊。 6． 加入 10ml 細胞核裂解液到重懸的白細胞，再加入 50ul 蛋 白酶 K（20mg/ml）,適度吹打幾次混勻，以裂解白細胞，由于有部 分基因組 DNA 釋放出來，這個時候混合物會變得十分粘稠，立刻停 止吹打（以免剪切斷基因組 DNA），在 65℃溫育 3-4 小時（或 60℃ 過夜消化）至裂解完全，期間顛倒混勻數次。若還有沒裂解，可直 接離心取上清。 7． 可選步驟：在裂解物中加入 RNase A（10mg/ml）至終濃度 30μg/ml， 8．恢復室溫后加入 3.33ml 蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振 蕩混勻 20-25 秒?；靹蚝罂赡芤姷揭恍┬〉牡鞍讏F塊。 由于樣品體積重量小，用渦旋振蕩器振蕩混勻產生的剪切力并不會剪切打斷基 因組 DNA，如果用手振蕩混勻，則不可以用手上下劇烈振蕩混勻，只能適當力 度振蕩混勻，否則會剪斷基因組 DNA，但是力度也不能小,要保證充分混勻，將 粘稠的裂解物打散開，否則 DNA 無法和蛋白質沉淀分離開， 離心的時候會和 蛋白質一起沉淀下來，造成 DNA 丟失或者降低產量。此外混勻不充分也可能造 成蛋白沉淀不充分, 最后的產物污染有較多量的蛋白質。因此建議新手還是用渦 旋振蕩器混勻。 9．5,000rpm (可根據離心效果(沉淀如果不緊)調整加大離心力)離心 10 分鐘。這時候應該可以見到管底暗褐色的蛋白沉淀，也可能見到一些 蛋白沉淀漂浮在液體表面。 10．小心吸取上清（大約 10ml）到一個新的 50ml 離心管中。 吸取上清時小心不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀，如果不小心將 蛋白沉淀轉入新的離心管中，可再次離心 2 分鐘后取上清。 11．加入等體積的室溫異丙醇（約 10ml），輕柔顛倒 30 次混勻或者直到 出現(xiàn)棉絮狀（絲狀）白色 DNA 沉淀。 注意有時候棉絮狀（絲狀）DNA 沉淀顛倒混勻的時候，粘附著在蓋子或者管口 處，即使顛倒也不跟下來，或者附著有氣泡導致漂浮在液面，這樣導致操作者 看不到沉淀，誤認為沒有得到 DNA。解決辦法是略去步驟 12，直接 2，000 x g 離心 1 分鐘，棄上清，然后接步驟 14。 12．垂直放置離心管，讓白色 DNA 沉淀自然沉到管底，然后盡可能多的 吸棄大部分的上清，注意不要吸到沉淀。 13．加入 10ml70％乙醇后，顛倒混勻，5,000rpm 離心 5 分鐘，在管底可 以見到白色的 DNA 沉淀塊，倒棄上清。 14．加入 3ml70％乙醇，顛倒幾次漂洗 DNA 沉淀，5,000rpm 離心 5 分鐘, 倒去上清（沉淀很松，注意不要把 DNA 沉淀倒掉了），倒置后在吸 水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀 周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。 注意不要干燥過頭，否則 DNA 極其難溶，也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能 抑制下游如酶切反應。 15．加入 600μlDNA（或者根據濃度需要調整用量）溶解液重新水化溶 解 DNA 沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在 65℃溫育 30-60 分鐘（不 要超過一小時），也可以在室溫或者 4℃放置過夜來重新水化 DNA， 中間不時的輕彈管壁幫助重新水化 DNA。 16. DNA 可以存放在 2-8℃,如果要長時間存放，可以放置在-20℃。 六、疑難解答（Trouble shooting） 出現(xiàn)的問題 可能的原因 建議解決方法 紅細胞裂解不完全 血液標本裂解前沒有回復 到室溫 處理前先把血液標本回復到室 溫。 裂解時間不夠 可延長裂解時間至 15 分鐘以上。 裂解過程中沒有多次混勻 裂解過程中可以更多次顛倒混 勻，或者輕彈管壁幫助裂解。 DNA產量低 血液標本中本身含有的白 細胞數量低 增加起始血液處理量 白細胞裂解不完全 仔細閱讀步驟 6 的操作要領。加 入裂解液之前，必須劇烈渦旋振 蕩打散重懸白細胞沉淀團塊，否 則很難裂解完全。如果是肝素抗 凝的血樣，白細胞團塊很難打散， 加入裂解液后應該在 65℃溫育幫 助裂解直到看不見細胞團塊。白 細胞數量太大超出裂解能力，適 當增加細胞核裂解液體積。 血液標本存放時間太長 存放在4℃的血液標本超過5天的 產量可能大大降低，因此不要存 放太久。 DNA 沉淀在洗滌的時候 丟失了 異丙醇沉淀后用乙醇洗滌的過程 中，倒棄上清的時候要格外小心， 不要把 DNA 沉淀也倒掉了。 接前表 出現(xiàn)的問題 可能的原因 建議解決方法 DNA長度小于20kb 血液樣品太老或者不正確 的存放，造成 DNA 降解 選用新鮮的血液樣品。 操作不當，造成對基因組 DNA 的剪切 混勻輕柔，不可以用手劇烈振蕩離心 管，選用大口徑的槍頭轉移或者混勻 DNA。 未見到蛋白沉淀 加入蛋白沉淀液前，裂解 混合物沒有冷卻回室溫 冷卻至室溫或者冰上放置 5 分鐘后 再加入蛋白沉淀液。 蛋白沉淀液沒有和裂解混 合物充分混勻 應該連續(xù)高速渦旋振蕩混勻 25 秒， 渦旋并不會剪切斷 DNA。 A260/A280 <1.6 污染有蛋白質 看看上述“未見到蛋白沉淀”問題的 解決方法，確保蛋白通過沉淀去除。 另外請參見步驟 9，防止蛋白污染。 測定吸光值時用水稀釋 DNA 會降低 A260/A280 使用TE緩沖液來稀釋DNA,保證PH 值大于 8.0。 DNA沉淀難以重新 溶解水化 晾干 DNA 沉淀時過度了 晾干時候密切觀察，不要干燥過頭， 注意應該觀察管底的 DNA 沉淀，有 時候管壁上的殘留乙醇已經揮發(fā)，但 留下一些水分還沒有干，只要管底 DNA 干了就可以加入 DNA 溶解 液。可在 65℃溫育幫助重新溶解（不 要超過一小時）然后室溫或者 4℃放 置過夜，期間可以顛倒輕彈幫助溶 解。 下游酶切切不開 DNA 未干燥完全，殘留乙 醇太多 敞開離心管口，在 65℃溫育幾分鐘， 讓乙醇揮發(fā)。