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NMY51 Chemically Competent Cell 產(chǎn)品說明書
NMY51: 10×100μl 保存條件：- 80℃
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存條件：- 80℃
Carrier DNA (5 μg/μl) 100μl 保存條件：-20℃
PEG/LiAC: 5ml 保存條件： 4℃
MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4
產(chǎn)品說明
DUAL membrane系統(tǒng)是DUAL systems BioTech公司開發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測技術(shù)，它利用分離的泛素系統(tǒng) (split-ubiquitin)直接檢測天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上唯一檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進行蛋白互作驗證或篩庫試驗；此菌株Transformation marker為：trp1，leu2-3，報告基因為：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通過營養(yǎng)缺陷型報告基因 (HIS3，ADE2)進行選擇性生長篩選，進一步通過 LacZ報告基因進行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個獨立的報告基因，受不同啟動子的調(diào)控，降低假陽性幾率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa殘基組成；泛素作為降解信號分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的 N端，然后被泛素專一性蛋白酶 (UBPs)識別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人為地將泛素 Nub的 3位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼?(NubI 突變?yōu)?NubG)。這樣與 Cub的親合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我結(jié)合或接近的可能性。其次，將Cub部分與人工合成的 LexA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結(jié)合，UBPs也不能識別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子也不會被切下來。最后，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs識別，導(dǎo)致 LexA-VP16的解離，進入核內(nèi)，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。 此系統(tǒng)可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標(biāo)志均為LEU；三種Prey質(zhì)粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標(biāo)志均為TRP。NMY51感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA。
1. 取100 μl冰上融化的NMY51感受態(tài)細胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 μg，Carrier DNA (95-100度5min,快速冰浴，重復(fù)一次）10 μl，PEG/LiAc 500μl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
3. 5000 rpm離心 40s棄上清，ddH2O 400 μl 重懸，離心 30s棄上清。
4. ddH2O 50 μl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。
注意事項
1. 感受態(tài)細胞最好在冰上融化。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。
4. NMY51酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。