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RT-PCR引物設計原則和方法
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在NCBI上搜索到該基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象。 打開Primer Premier5，點擊File-New-DNA sequence, 出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內（選擇As），此窗口內，序列也可以直接翻譯成蛋白。點擊Primer，進入引物窗口。 此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結果”選項，點擊Search按鈕，進入引物搜索框，選擇“PCR primers”，“Pairs”，設定搜索區(qū)域和引物長度和產物長度。在Search Parameters里面，可以設定相應參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認即可，但產物長度可以適當變化，因為100～200bp的產物電泳跑得較散，所以可以選擇300～500bp。 點擊OK，軟件即開始自動搜索引物，搜索完成后，會自動跳出結果窗口，搜索結果默認按照評分（Rating）排序，點擊其中任一個搜索結果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。 對于引物的序列，可以簡單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3’端不要以A結尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出現(xiàn)連續(xù)的3個堿基相連的情況，比如GGG或 CCC，否則容易引起錯配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應該在55～70度之間，GC％應該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級結構信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級結構，點擊該紅色按鈕，即可看到相應二級結構位置圖示。最理想的引物，應該都不存在這些二級結構，即這幾個按鈕都顯示為“None”為好。但有時很難找到各個條件都滿足的引物，所以要求可以適當放寬，比如引物存在錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何，是否會明顯影響產物。對于引物具體詳細的評價需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質量感覺不如Primer5。 在 Primer5窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結果窗口中，點擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Current pair，使用PDF虛擬打印機，即可轉換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細信息。 在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇 Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經被保存為Seq文件），會跳出來兩個窗口，分別為Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點擊最左下角的按鈕，會出來引物定位對話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經給出）即可，而引物長度可以通過點擊Change－Current oligo length來改變。定位后，點擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強大的引物分析功能了。 Analyze中，第一項為Key info，點擊Selected primers，會給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method計算，會比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的Delta G和3’端的Delta G。3’端的Delta G過高，會在錯配位點形成雙鏈結構并引起DNA聚合反應，因此此項絕對值應該小一些，最好不要超過9。 Analyze中第二項為 Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇 Upper/Lower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應異常的重要因素，因此應該避免設計的引物存在二聚體，至少也要使設計的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其Delta G值應該偏低，一般不要使其超過4.5kcal/mol，結合堿基對不要超過3個。Oligo此項的分析窗口中分別給出了3’端和整個引物的二聚體圖示和 Delta G值。 Analyze中第三項為Hairpin Formation，即發(fā)夾結構分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，Delta G值不要超過4.5kcal/mol，堿基對不要超過3個。 Analyze 中第四項為Composition and Tm，會給出上游引物、下游引物和產物的各個堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之間的GC％不要相差太大。Tm值共有3個，分別采用三種方法計算出來，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一種應該是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之間。 第五項為False Priming Sites，即錯誤引發(fā)位點，在Primer5中雖然也有False priming分析，但不如oligo詳細，并且oligo會給我正確引發(fā)效率和錯誤引發(fā)效率，一般的原則要使錯誤引發(fā)效率在100以下，當然有時候正確位點的引發(fā)效率很高的話，比如達到400～500，錯誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。 Analyze中，有參考價值的最后一項是“PCR”，在此窗口中，是基于此對引物的PCR反應Summary，并且給出了此反應的最佳退火溫度，另外，提供了對于此對引物的簡短評價。若該引物有不利于PCR反應的二級結構存在，并且Delta G值偏大的話，Oligo在最后的評價中會注明，若沒有注明此項，表明二級結構能值較小，基本可以接受。 引物評價完畢后，可以選擇 File－Print，打印為PDF文件保存，文件中將會包括所有Oligo軟件中已經打開的窗口所包括的信息，多達數(shù)頁。因此，打印前最好關掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二級結構分析窗口（若存在可疑的異常的話）和PCR窗口。 引物確定后，對于上游和下游引物分別進行Blast分析，一般來說，多少都會找到一些其他基因的同源序列，此時，可以對上游引物和下游引物的blast結果進行對比分析，只要沒有交叉的其他基因的同源序列就可以。 有一個問題，引物設計原則里面常常強調，引物所對應模板序列的Tm 值最好在72℃左右，但是軟件里面Search出來的引物，很少有達到這個值的，一般都在50～65度之間，這是什么原因？軟件怎么沒有限定這個規(guī)則？ |